Российские ученые создали первый в мире комбинированный тест на ВИЧ, гепатиты B, C и сифилис

Весомая часть работы диагностических лабораторий всего мира приходится на исследование именно этой «госпитальной четверки».

Гепатит B. Alamy/TASS

Борьба добра со злом

Эта история началась в 1881 г., когда Луи Пастер случайно заразил кур старой культурой возбудителя холеры. Птицы заболели, но не погибли. Пастер повторил опыт на этих же птицах, взяв свежую культуру. Куры снова остались живы. Так было доказано, что ослабленная культура возбудителя болезни каким-то образом готовит организм к встрече с сильным микробом. С этого момента началась наука иммунология, благодаря которой в мире есть «волшебные» вакцины от множества опаснейших болезней.

Разгадывая механизм работы инфекций, ученые постепенно выяснили, что человеческий организм обладает универсальной и очень хорошо работающей защитой — иммунной системой, которая первой обнаруживает молекулы любого возбудителя болезни. Эти «вражеские» молекулы ученые называют антигенами. Чаще всего это особые белки, в структуре которых есть небольшой участок так называемой антигенной детерминанты. Иммунная система узнает «врага» именно по этому участку антигена.

Понятно, что разоблаченный враг должен быть уничтожен. Иммунная система этим и занимается. Иммунный ответ организма довольно сложен, но его главной составляющей всегда является выработка так называемых антител. Это тоже белки. Но они обладают уникальным свойством: связываясь с антигеном, они его полностью нейтрализуют. Иммунная система человека может производить миллиарды различных антител, чей тип зависит от того, какой именно «враг»-антиген напал на организм. Во время болезни внутри нас разыгрываются настоящие битвы добра со злом. Антитела в буквальном смысле набрасываются на антигены, после чего врага можно считать обезвреженным.

Изучению механизма иммунной защиты организма биологи посвятили весь прошлый век. С 1901 года нобелевскими лауреатами за работы в области иммунологии стали 17 выдающихся ученых. Иммунная диагностика, появившаяся в медицинском обиходе после Второй мировой войны, основана как раз на этом свойстве организма порождать строго определенные антитела для связывания строго определенных антигенов.

Четверка врагов

Среди самых опасных инфекционных заболеваний, наличие которых у пациента надо определить в первую очередь, первое место занимает так называемая госпитальная четверка: гепатиты В и С, сифилис и ВИЧ. Тест на «госпитальную четверку» хотя бы раз в жизни проходил почти каждый россиянин. Этим исследованиям в обязательном порядке подвергается 10 категорий граждан: все, кто собирается лечь в больницу с любым диагнозом, заключенные, мигранты, беременные женщины, люди, работающие в силовых структурах, наркозависимые, дети из учреждений закрытого типа и люди, находящиеся в зоне риска или уже страдающие одним из заболеваний госпитальной четверки.

Как делается тест? В каждой лаборатории есть четыре вида диагностических наборов, по одному на каждое из четырех заболеваний. Основной компонент набора — планшет с 96 лунками, на поверхность которых нанесены антитела. Четыре болезни — четыре планшета. Пациент сдает кровь, из нее выделяют сыворотку, которую помещают в лунку каждого из четырех планшетов. Работа лаборанта с одним планшетом обычно занимает два часа. Чтобы получить результаты по четырем болезням, надо обработать четыре планшета. На все про все у одного лаборанта уходит весь рабочий день. 

Компания «Биопалитра» — одна из немногих российских биотехнологических компаний, специализирующихся на разработке систем для иммунной диагностики социально значимых заболеваний. В 2012 году она начала выпуск классических наборов для диагностики госпитальной четверки, то есть четырех тест-систем для четырех болезней. Однако по мере получения статистических данных и отзывов пользователей у биологов «Биопалитры» стали возникать мысли о том, что классическую методику можно упростить, удешевить и улучшить.

— Мы обратили внимание на то, что, во-первых, более 50% пациентов назначается диагностика по всем четырем заболеваниям, — говорит директор по развитию компании, инженер-химик Андрей Березин. — Во-вторых, в 95% случаях, согласно статистике, результат анализов на все четыре инфекции отрицательный. Эти болезни — не простуда, и подавляющее большинство людей, ведущих обычный образ жизни, ими не страдают. Как правило, требуется просто подтвердить, что пациент чист. В-третьих, если у человека есть хотя бы одно из этих заболеваний, высока вероятность, что присутствует и какое-то другое из той же четверки. По нормам российского законодательства диагностирование всей госпитальной четверки назначается не всегда. Например, беременных женщин обязательно тестируют на гепатит В и ВИЧ, но не тестируют на гепатит С и сифилис. И мы подумали, что было бы правильным разработать универсальное тестирование для всей четверки среди всех групп населения. Это с одной стороны, сильно упростило бы жизнь лаборантам, а с другой — российский Минздрав получил бы дополнительные данные по заболеваемости.

Сэндвич для гепатита С

Метода, который позволял бы делать тест по принципу «одна лунка-четыре болезни», просто не было. Для этого все тесты должны выполняться по одной технологии. Но если ВИЧ, гепатит В и сифилис действительно исследуются с помощью одного так называемого сэндвич-метода, то гепатит С — нет.

Тут нам придется разобраться с тонкостями иммунной диагностики. Классический иммунный тест работает так. На поверхность лунки планшета нанесены антитела, допустим, к вирусу ВИЧ. После этого в лунку добавляется сыворотка крови пациента. Если в сыворотке есть вражеский антиген, он связывается с антителами. Антител, как правило, добавляется много, и не все они находят «свои» антигены. 

Когда часть антител соединилась с антигенами, лаборант удаляет лишние, после чего уже в сухую лунку добавляет реактив конъюгат. Это то же антитело, что и на дне лунки. Но привязано оно не к лунке, а к специальному ферменту пероксидазе. Конъюгат также связывается с оставшимися антигенами вируса. Получается то, что биологи называют сэндвичем: снизу поверхность лунки с антителами, в середине антиген, сверху те же антитела, но уже с пероксидазой на хвосте.

Дальше надо снова промыть лунку и удалить весь конъюгат, не связавшийся с вирусом. После этого в лунку добавляется краситель. Он реагирует на наличие связанной тройки — антиген-антитело-пероксидаза. Если лунка окрашивается в желтый цвет, значит тройка антиген-антитело-пероксидаза сложилась — пациент болен.

Однако в случае гепатита С этот прекрасный сэндвич-метод, увы, не работает. Та самая антигенная детерминанта вируса, с которой должно соединиться антитело, у гепатита С устроена так, что зацепиться за нее очень трудно. Для диагностики гепатита С применяется другой, так называемый конкурентный метод. Внешне все выглядит так же. Антитела нанесены на поверхность лунки, в лунку добавляют сыворотку крови, антиген вируса связывается с антителом.

Дальше лунку промывают и добавляют специальный реагент. Однако этот реагент обнаруживает не пару антиген-антитело, а те антитела, за которые вирус не зацепился. Если классический сэндвич-метод это как бы позитив болезни, то конкурентный метод выглядит как ее негатив. Когда лунка желтеет при диагностике сэндвич-методом, дело плохо: человек болен. Но если пожелтела лунка при конкурентном методе, это хорошо: человек здоров. И как два этих метода соединить в одной лунке?

Выходило, что для создания универсального теста на госпитальную четверку, надо придумать, как диагностировать гепатит С сэндвич-методом. Биотехнологи начали с того, что снова внимательно изучили молекулу антигена гепатита С. После долгих экспериментов они сумели найти в антигене гепатита С нужный участок для закрепления антитела. Теперь надо было так изменить конструкцию молекулы конъюгата, чтобы она могла связываться с белками вируса не в обычной точке детерминанты, а в новой. Это, в конце концов, тоже было сделано.

Теперь диагностику гепатита С можно было проводить традиционным сэндвич-методом. Но радоваться было рано.

Пятерка против четверки

— Размеры планшетов у нас фиксированные, — говорит Андрей Березин. — Мы строго ограничены площадью поверхности лунки. У всех четырех заболеваний возбудители могут иметь несколько разновидностей. У гепатита С это четыре разных белка. У гепатита В — три. У ВИЧ вообще семь. Антитела к каждой из этих разновидностей тоже разные. Чтобы точно диагностировать болезнь, на дно лунки надо нанести все разновидности антител. Когда мы все это сливаем вместе, получается коктейль из более чем 20 разных антител. А это значит, что чувствительность по каждому вирусу автоматически понижается примерно в 20 раз. Но чувствительность — одна из важнейших характеристик любой тест-системы, ее понижать нельзя.

 И тут ученым помогла та самая пероксидаза, которая «висит на хвосте» конъюгата. Пероксидаза — это тоже белок. С ее помощью уже много десятилетий ученые могут визуализировать результаты иммунных реакций. Сама пероксидаза не является красителем. Но именно ее наличие заставляет краситель менять цвет, если тройка антиген-антитело-пероксидаза образовалась. Чем больше «вражеских» антигенов соединилось с парой антитело-пероксидаза, тем желтее будет лунка. Но…

— Если слить все эти антитела и антигены, — объясняет Березин. —Пероксидазы в растворе станет катастрофически мало в пересчете на каждый тип вируса. А ведь краситель реагирует именно на пероксидазу. В итоге мы можем просто не поймать этот сигнал. Но нам повезло. В копилке «Биопалитры» оказалась еще одна полезная технология. Мы давно производим и поставляем некоторым компаниям так называемую полиметку или полипероксидазу. Это такой специфический реагент, который состоит из молекулы антитела, к которой прицеплена не одна молекула пероксидазы, а сразу пять. Получается, что на антителе сверху образуется что-то вроде пероксидазного «дерева». Если добавить в лунку эту полипероксидазу, мы в пять раз увеличим чувствительность системы. Так, соединив сэндвич-метод и технологию полипероксидазы, мы подняли уровень чувствительности нашей тест-системы до нормативов лабораторной диагностики.

Получившаяся методика выглядит вполне традиционно. Все как обычно: лунка, сыворотка, конъюгат, краситель. Но исследуется при этом не одно, а все четыре заболевания одновременно.

Понятно, что эта универсальная тест-система не позволяет узнать, какой из четырех болезней страдает пациент. Но это и неважно. Главное быстро дать отрицательный ответ. Если же тест положительный, ничто не мешает сделать пациенту повторный скрининг по классической схеме из четырех планшетов и выяснить, что конкретно не так.

Врачи довольны

Новая тест-система «Биопалитры» — прекрасный пример того, как современная наука может менять рынок медицинских технологий. В начале 2018 года Фонд развития промышленности (Группа ВЭБ.РФ) предоставил «Биопалитре» льготный заем в размере 50,7 млн рублей на серийный запуск производства комбинированных тест-систем собственной перспективной разработки. Общий бюджет проекта превысил 137 млн рублей.

В июне прошлого года ученые из «Биопалитры» получили регистрационное удостоверение на свою разработку. Она уже прошла обязательные клинические испытания более чем на 17 тыс. образцов и дополнительные испытания в крупных медицинских центрах: НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского и Орловской станции переливания крови. Уже известно, что экономическая выгода от внедрения новой тест-системы составляет более 20%. В конце апреля этого года тест ушел в серийное производство. Теперь перед учеными-технологами из «Биопалитры» стоит задача завоевать рынок.

— Рынок клинической диагностики госпитальной четверки вообще-то очень большой, — говорит Березин. — Но очень консервативный. Нам необходимо преодолеть скепсис, объяснить буквально каждому медику, как это работает. Не только врачам, но и лаборантам надо рассказать, что никаких дополнительных навыков для обращения с нашей системой не требуется. Не требуется и переоснащение лаборатории. В данный момент мы формируем свою клиентскую базу. Это небыстрый процесс. Наша цель — в ближайшие три года занять не менее 10% рынка исследований на госпитальную четверку. Мы рассчитываем, что наш тест и новый подход существенно снизит нагрузку на здравоохранение России.

СЛОВАРЬ

Иммунная система — это специальная система органов и тканей, существующая у позвоночных животных. Ее задача — защитить организм от чужеродных агентов: болезнетворных микроорганизмов, инородных тел, ядовитых веществ и переродившихся клеток самого организма.

Антиген — (antibody generator — «производитель антител») любое вещество, которое организм рассматривает как чужеродное или потенциально опасное. Так как антиген несет в себе признаки генетически чужеродной информации, он может быть распознан иммунной системой организма. Чтобы обезвредить антиген, организм обычно начинает вырабатывать собственные антитела.

Антитело — белки сыворотки крови, которые вырабатываются в ответ на проникновение антигена. Главная роль антител — это распознавание чужеродного материала (антигена) и запуск механизма его уничтожения.

Антигенная детерминанта или эпитоп — это структурная часть белка-антигена, с которой связывается антитело. Другими словами, это некий аминокислотный крючок. Во-первых, при его наличии иммунная система узнает, что перед ней антиген. Во-вторых, именно за этот «крючок» может зацепиться антитело и нейтрализовать антиген.

• #Медицина